药物缀合物及其使用方法与流程2025/6/27喷瓜动图

　　2.本技术要求2019年5月22日提交的美国临时专利申请62/851,443的权益，所述申请通过引用以其全部并入本文。

　　3.癌症化疗药物通常受到狭窄的治疗窗——最小有效剂量(杀死肿瘤)和最大耐受剂量(引起显著副作用)之间的差异——的限制。靶向药物递送提供了一种增加肿瘤处局部浓度同时降低脱靶毒性的方法。抗体

　　药物缀合物(adc)构成当前用于靶向药物递送的主要平台。adc已显示出针对血液肿瘤的巨大临床成功，但其对许多实体瘤和其他困难肿瘤靶标(例如脑肿瘤、胰腺肿瘤等)的疗效有限。由于其相对较高的分子量(mw)，adc的均匀穿透实体瘤的能力受到阻碍。需要具有改变的药代动力学的替代靶向蛋白以提高针对实体瘤和其他困难肿瘤靶标的靶向治疗的功效。

　　4.提供了缀合物。在某些方面，提供了药物缀合物，其包括包含与细胞表面分子结合的工程环的扭结菌素(knottin)肽，以及通过接头与扭结菌素肽缀合的抗微管剂。在一些方面，提供了包括融合蛋白的药物缀合物，所述融合蛋白包括含有工程环的扭结菌素肽，该工程环与细胞表面分子结合，该融合蛋白与抗体亚基或其片段融合。这种药物缀合物还包括与融合蛋白缀合的药物。还提供了包括本公开的缀合物的组合物和试剂盒。还提供了使用缀合物的方法，例如用于治疗目的。

　　mmae的示意图，它是mmae的一种衍生物，在细胞外是稳定的，并在细胞内化时通过组织蛋白酶裂解。(b)根据本公开的一些实施方案的与mmae衍生物缀合的扭结菌素、扭结菌素

　　正缬氨酸被取代以允许kdc的位点特异性生物缀合的位点。位置31(红色x2)表示苯丙氨酸被酪氨酸取代的位点，以允许使用uv

　　mmae是mmae的衍生物，已知在细胞外稳定，并在细胞内化时通过组织蛋白酶裂解。(b)扭结菌素

　　ms。方法包括在30％溶剂b下等度保持2分钟，然后在15分钟内从30％到100％溶剂b的线f

　　mmae是mmae的衍生物，已知在细胞外稳定，并在细胞内化时通过组织蛋白酶裂解。(b)通过醛标记的kfc与hips接头mmae衍生物的hydrazino

　　mmae是mmae的衍生物，已知在细胞外稳定，并在细胞内化时通过组织蛋白酶裂解。(b)通过醛标记的(α

　　13.图9扭结菌素靶向蛋白对u87mg细胞的结合亲和力。(a)af488标记的k、kfc和kab与u87mg细胞的直接结合(k的kd＝0.35nm，kfc的kd＝2.5nm和kab的kd＝2.3nm)。(b)与1nm af488

　　2.5f竞争的药物缀合物的间接结合(kdc的ki＝0.9，kfc的ki＝1.2，kab的ki＝1.3)。

　　14.图10基于扭结菌素的蛋白质的内化。(a)仅与抗alexa fluor 488淬灭抗体温育或在4℃温育(以冷冻细胞膜并抑制内化)的细胞仅在细胞上方具有可检测的荧光。(b)af488标记的k、kfc和kab的内化。(c)与单价单臂kfc相比，二价kfc的内化。(d)与n端kab和kfc相比，c端扭结菌素

　　15.图11变性培养基和pbsa对内化的影响。血清蛋白，包括c1q，能够与抗体fc区相互作用，并可能影响细胞内化。为了测试血清蛋白是否影响内化率，将细胞与af488标记的蛋白在完全培养基(dmem)、热变性dmem或含0.1％bsa的磷酸盐缓冲盐水(pbsa)中温育。

　　17.图13pdc抑制体外细胞增殖。用mmae处理的u87mg细胞，与(a)kdc和未结合的k，(b)kfdc和未结合的kfc，以及(c)kadc和未结合的kab比较。通过测量由cck8试剂在λ＝450nm处产生的吸光度来评估120小时的细胞增殖，并报告为相对于未处理细胞的百分比最大值。在另外的实验中再次测试所有药物缀合物并在(d)中一起作图。

　　18.图14随时间的pdc抑制细胞增殖和细胞毒性。用mmae或药物缀合物处理表达rfp的u87mg细胞，并通过incucyte成像随时间测量增殖和细胞毒性(通过sytox绿)。(a)24小时后在用含有相同处理条件的新鲜培养基洗涤的细胞之间比较增殖。(b)24小时后在用新鲜无药物培养基洗涤的细胞之间比较增殖。(c)24小时后在用含有相同处理条件的新鲜培养基洗涤的细胞之间比较细胞毒性。(d)24小时后在用新鲜无药物培养基洗涤的细胞之间比较细胞毒性。

　　19.图15温育3小时后pdc抑制增殖。用mmae或药物缀合物处理表达rfp的u87mg细胞，并通过incucyte成像随时间测量增殖。3小时后在用新鲜无药物培养基洗涤的细胞之间比较增殖。

　　20.图16af680标记的pdcs的体内成像。将携带u87mg髋关节异种移植物的小鼠注射1.5nmol的(a)af680

　　kadc。使用640nm激发和710nm发射滤光片定期对小鼠(n＝3)成像。在选定的时间点显示来自每个处理组的单只小鼠，以说明清除率和定位率的差异。

　　kadc处理的小鼠的肿瘤或以肩部(背景)为中心的等效区域的辐射效率的量化。通过将双相指数衰减曲线拟合到背景数据来估计循环半衰期。(d

　　22.图18pdc的生物分布。给携带u87mg异种移植肿瘤的小鼠注射1.5nmol的荧光标记的药物缀合物。施用后4和24小时取出肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、心脏、肺、膀胱、股四头肌(肌肉)和胸骨(骨)用于成像。

　　23.图19携带u87mg髋关节异种移植物的nu/nu小鼠的肿瘤生长，该小鼠每周用pbs、kdc、kfdc或kadc处理三次，持续三周。每个剂量包含适当的药物缀合物，归一化为2.38nmol mmae(～0.6mg/kg kdc、～5mg/kg kfdc、～10mg/kg kadc)。终点标准是肿瘤面积100mm2。(a)kaplan

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。(d)以起始重量归一化的平均重量。

　　24.图20携带u87mg髋关节异种移植物的nu/nu小鼠的肿瘤生长，该小鼠每周用pbs、未缀合的k、或1mg/kg或5mg/kg kdc处理一次，持续四周。终点标准是肿瘤面积150mm2。(a)kaplan

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。

　　25.图21携带u87mg髋关节异种移植物的nu/nu小鼠的肿瘤生长，该小鼠每周用pbs、未缀合的kfc、或5mg/kg或10mg/kg kfdc处理一次，持续四周。终点标准是肿瘤面积150mm2。(a)kaplan

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。

　　26.图22携带u87mg髋关节异种移植物的nu/nu小鼠的肿瘤生长，该小鼠每周用pbs、未缀合的(α

　　cea)kab、或5mg/kg或10mg/kg kadc处理一次，持续四周。终点标准是肿瘤面积150mm2。(a)kaplan

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。

　　28.图24以30mg/kg给药的kadc的治疗功效。携带u87mg髋关节异种移植物的nu/nu小鼠的肿瘤生长，该小鼠每周用pbs、10mg/kg kadc或30mg/kg kadc处理一次，持续四周。终点标准是肿瘤面积150mm2。(a)kaplan

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。

　　29.图25kadc和kab共同施用的治疗效果。携带u87mg髋关节异种移植物的nu/nu小鼠的肿瘤生长，该小鼠每周用pbs、10mg/kg kadc或与20mg/kg kab共同施用的10mg/kg kadc

　　meier生存曲线。(b)每个处理组的平均肿瘤面积。达到安乐死标准的小鼠被包括在平均值中作为它们最后记录的肿瘤面积。(c)每组内单个小鼠的肿瘤测量。

　　30.图26kdc、kfdc和kadc的肝脏和肾脏组织学。肝脏和肾脏的代表性切片用4％pfa固定并用苏木精和伊红染色以显示细胞结构。载玻片由独立兽医病理学家评分，所有肝脏和肾脏样品均被证实没有急性毒性证据。

　　31.图27扩散到实体瘤。代表药物缀合物远离脉管系统并进入实体瘤的krough圆柱扩散的示意图。krough圆柱半径受扩散率和细胞结合和内化率的限制。

　　32.图28肿瘤球体的共聚焦成像。共聚焦成像显示af488标记的药物缀合物扩散到表达细胞rfp的u87mg球体中。红色通道显示由于光密度引起的信号衰减；绿色通道显示荧光标记蛋白质的强度。所有图像均在距球体表面约100μm的深度处拍摄。

　　33.图29肿瘤球体成像的量化。球体图像定性有用，但由于光密度不均匀，量化具有挑战性。红色通道显示由于光密度引起的信号衰减，而绿色通道显示荧光标记的蛋白质。对于每个通道，使用fiji图像分析软件计算径向强度并绘制为距离的函数。(a)用af488

　　kadc和未标记的k处理的n＝5球体的平均强度与距离的函数关系。(e)使用相对红色强度校正的相对绿色强度。(f)在100μm处拍摄的共焦图像的总积分强度。

　　35.图31在体外杀死肿瘤球体。在用不同浓度的kdc、kfdc、kadc或mmae处理之前，使u87mg肿瘤球体生长3天。温育4天后，加入sytox绿并搅动球体以测量细胞毒性。通过将绿色信号与用裂解缓冲液杀死的球体进行比较来估计球体死亡百分比。

　　36.图32体外肿瘤球体的incucyte成像。在用100um kdc、kadc或mmae处理之前，使表达rfp的u87mg肿瘤球体生长3天。细胞死亡用sytox绿可视化。处理后120小时拍摄图像。

　　37.在更详细地描述本公开的缀合物、组合物和方法之前，应理解缀合物、组合物和方法不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以对其进行改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不旨在限制，因为缀合物、组合物和方法的范围仅受所附权利要求的限制。

　　38.在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一和所述范围内的任何其它所述或中间值均涵盖在缀合物、组合物和方法中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且还涵盖在缀合物、组合物和方法中，受所述范围内的任何具体排除的界限。在所述范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些包括的界限之一或两者的范围也包括在缀合物、组合物和方法中。

　　39.本文给出的某些范围的数值前面有术语“约”。术语“约”在本文中用于提供对其之前的确切数字以及接近或近似该术语之前的数字的文字支持。在确定一个数字是否接近或

　　近似一个具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供该具体列举的数字的实质等同物的数字。

　　40.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与缀合物、组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管任何与本文所述那些相似或等同的缀合物、组合物和方法也可用于缀合物、组合物和方法的实践或测试，但现在描述代表性的示例性缀合物、组合物和方法。

　　41.本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与引用所述出版物相关的材料和/或方法。任何出版物的引用均为其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本缀合物、组合物和方法无权先于此类出版物，因为所提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。

　　42.应注意，除非上下文另有明确说明，否则如本文和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示物。还应当注意，权利要求书可以被起草为排除任何任选的元素。因此，本声明旨在用作使用与权利要求元素的记载相关的“单独”、“仅”等专用术语或使用“否定”限制的引用基础。

　　43.应理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的缀合物、组合物和方法的某些特征也可以以组合形式提供在单个实施方案中。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的缀合物、组合物和方法的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施方案的所有组合由本公开具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个组合被单独和明确地公开，在这个意义上这种组合包括可操作的方法和/或组合物。另外，描述这种变量的实施方案中列出的所有子组合也由本缀合物、组合物和方法具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个这种子组合在本文中单独和明确地公开。

　　44.本领域技术人员在阅读本公开时将理解，本文描述和示例的每个单独实施方案具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其它几个实施方案的特征分离或组合而不脱离本方法的范围或精神。任何记载的方法可以按照所记载事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

　　46.如上文所概述的，本公开提供了缀合物。例如，本文描述了作为癌症治疗的替代靶向剂的基于肽的药物缀合物的工具箱的开发和表征。传统的癌症化疗剂的有效剂量和毒性剂量之间的范围通常窄小。为了提高疗效并最大限度地减少副作用，蛋白质

　　47.本公开的缀合物包括扭结菌素肽，其包括与细胞表面分子结合的工程环。本公开的缀合物中采用的扭结菌素肽的类型可以变化。可以采用的扭结菌素肽的非限制性实例包括eeti

　　ii肽、蜘蛛毒素(agatoxin)肽和氯毒素肽。扭结菌素肽的三维结构最低限度地由三个二硫键的特定排列限定。这种特有的拓扑结构形成了一个分子结，其中一个二硫键穿过由其他两个链内二硫键桥形成的大环。尽管它们的二级结构含量通常较低，但扭结菌素共享一个小的三链反平行β

　　折叠，其由二硫键框架稳定。扭结菌素的折叠和功能活性通常由长度和氨基酸组成不同的环区域介导。虽然三个二硫键是限定该肽家族的折叠的最小数量，但扭结菌素还可以包含额外的半

　　胱氨酸残基，产生在其结构中具有四个或更多个二硫键和额外约束环的分子。术语“胱氨酸”是指其中硫基团通过二硫键连接到另一个氨基酸的cys残基；术语“半胱氨酸”是指该残基的

　　sh(“半胱氨酸”)形式。结合环部分可以与胱氨酸相邻，从而在结合环的一级序列中没有其他插入的胱氨酸。

　　48.该扭结菌素肽可以是在线扭结菌素数据库中描述的肽，该数据库包括数千种被鉴定为含有胱氨酸结基序的多肽的详细氨基酸序列、结构、分类和功能信息。扭结菌素存在于各种植物、动物、昆虫和线.扭结菌素肽可以是全长的(即，野生型肽/多肽的长度)，扭结菌素肽可以相对于野生型肽/多肽的长度被截短，或者扭结菌素肽可以包括额外的氨基酸，使得肽的长度相对于野生型肽/多肽更长。

　　药物缀合物(kdc)包括基于以下中任一种的扭结菌素肽：喷瓜(ecballium elaterium)胰蛋白酶抑制剂ii(eeti

　　ii肽、蜘蛛毒素(agatoxin)肽和氯毒素肽。在一些实施方案中，扭结菌素肽基于喷瓜胰蛋白酶抑制剂ii(eeti

　　[0051]“eeti”是指蛋白质数据库条目(pdb)2eti。它在扭结菌素数据库中的条目是eeti

　　[0053]“agrp”是指pdb条目1hyk和扭结菌素数据库条目swissprot agrp_human。agrp是132个氨基酸的神经肽，其与人脑中的黑皮质素受体结合，并参与调节新陈代谢和食欲。agrp的生物活性由其c端半胱氨酸结结构域介导，该结构域包含五个二硫键，但已开发出仅包含四个二硫键的完全活性的34个氨基酸的截短的agrp。在某些方面，本公开的缀合物的扭结菌素肽基于具有以下氨基酸序列的截短的agrp肽：

　　cvrlhesclgqqvpccdpaatcycrffnafcycr(seq id no:2)

　　根据某些实施方案，本公开的缀合物的扭结菌素肽基于具有以下氨基酸序列的kalata b1肽：

　　sgsdggvcpkilkkcrrdsdcpgacicrgngycg(seq id no:4)

　　mcmpcfttdhqmarkcddccggkgrgkcygpqclcr(seq id no:5)

　　ii、蜘蛛毒素(agatoxin)、氯毒素和本公开的缀合物的扭结菌素肽可以基于的其他扭结菌素肽的序列和结构(例如，环)信息可以在pdb、扭结菌素数据库和其他蛋白质数据库中找到。

　　扭结菌素肽包括与细胞表面分子结合的工程环，也就是说，该环被设计成与细胞表面的目标分子结合。扭结菌素包含三个二硫键，它们交织成一个分子

　　26)扭结菌素家族成员，其包括蛋白酶抑制剂、毒素和抗菌剂，除了其核心半胱氨酸残基外，几乎没有序列同源性。因此，它们的二硫键约束的环可以承受很多序列多样性，这使得扭结菌素适用于需要将突变引入蛋白质而不破坏其三维折叠的蛋白质工程应用。

　　工程环可以包括在扭结菌素肽的现有环中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或者工程环可以是添加到扭结菌素蛋白的环。即，除了野生型肽中存在的一个或多个环之外，缀合物的扭结菌素肽还可包括环。通过将定向进化与计算协方差分析相结合，已经阐明了将修饰(氨基酸序列和环长度两方面)引入扭结菌素支架的环区域中的指南。参见，例如，lahti et al.(2009)plos comput.biol.5(9):e1000499。

　　在一些实施方案中，扭结菌素的环被设计成与癌细胞表面分子结合。“癌细胞”是指表现出赘生性细胞表型的细胞，其特征可以是一种或多种，例如，异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制的丧失、非贴壁依赖性生长潜能、在免疫受损的非人动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力，和/或任何合适的细胞转化指标。“癌细胞”在本文中可以与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌细胞”互换使用，并且涵盖实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。这种工程化环赋予了扭结菌素肽一种在野生型肽中不存在的癌细胞表面分子识别特性。在某些方面，癌症是已知具有一种或多种肿瘤相关或肿瘤特异性细胞表面分子(例如，细胞表面受体、膜蛋白酶等)的癌症，并且扭结菌素肽的工程环被工程化以结合一种或多种此类肿瘤相关或肿瘤特异性细胞表面分子的细胞外结构域。“肿瘤相关细胞表面分子”是指在正常组织的细胞上表达受限的在恶性细胞上表达的细胞表面分子，或者与正常细胞相比以更高的密度在恶性细胞上表达的细胞表面分子。

　　任何肿瘤相关细胞表面分子或肿瘤特异性细胞表面分子均可被本公开的缀合物的扭结菌素肽靶向。在某些方面，环被工程化以结合的癌细胞表面上的靶标是her2、b7

　　h3(cd276)、cd19、cd20、gd2、cd22、cd30、cd33、cd56、cd66/ceacam5、cd70、cd74、cd79b、cd123、cd133、cd138、cd171、b细胞成熟抗原(bcma)、nectin

　　4、间皮素、跨膜糖蛋白nmb(gpnmb)、前列腺特异性膜抗原(psma)、slc44a4、ca6、酪氨酸蛋白激酶met(c

　　met)、表皮生长因子受体变体iii(egfrviii)、粘蛋白1(muc1)、ephrin a型受体2(epha2)、蛋白聚糖2(gpc2)、蛋白聚糖3(gpc3)、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、叶酸受体α(frα)、il

　　13受体α2(il13rα2)、成纤维细胞活化蛋白(fap)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、δ样3(dll3)、κ光链、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、滋养层糖蛋白(tpbg)、间变性淋巴瘤激酶(alk)、ca

　　根据某些实施方案，癌细胞表面上的靶标是受体，例如细胞粘附受体、可溶性因子(例如生长因子、趋化因子或其他可溶性因子受体)的受体、免疫细胞受体、或类似物。在某些方面，当受体是细胞粘附受体时，受体是整联蛋白。例如，本公开内容的缀合物可包括具有经工程改造以结合αvβ1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白、α5β1整联蛋白或其任何组合的环的扭结菌素肽。根据某些实施方案，工程化环结合αvβ1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白和α5β1整联蛋白中的每一个。

　　2.5d)(该结合环与αvβ1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白和α5β

　　gcpqgrgdwaptsckqdsdcragcvcgpngfcg(seq id no:6)

　　2.5f)(该结合环与αvβ1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白和α5β1整联蛋白中的每一个结合)具有以下氨基酸序列(带有下划线的是整合蛋白结合环)：

　　gcprprgdnppltcsqdsdclagcvcgpngfcg(seq id no:7)

　　在一些实施方案中，本公开的缀合物的扭结菌素肽是如表1中所列的结合整联蛋白的基于eeti的扭结菌素肽。

　　在一些实施方案中，本公开的缀合物的扭结菌素肽是如表2中所列的结合整联蛋白的基于agrp的扭结菌素肽。

　　克隆环4序列7a(5e)(seq id no:36)gcvrlhesclgqqvpccdpaatcycsgrgdndlvcycr7b(seq id no:37)gcvrlhesclgqqvpccdpaatcyckgrgdarlqcycr7e(seq id no:38)gcvrlhesclgqqvpccdpaatcycvgrgddnlkcycr7j(6b)(seq id no:39)gcvrlhesclgqqvpccdpaatcycegrgdrdmkcycr7c(seq id no:40)gcvrlhesclgqqvpccdpaatcycygrgdndlr cycr

　　在一些实施方案中，扭结菌素肽包括一种或多种非天然氨基酸。这种一种或多种非天然氨基酸可用于例如促进药物与扭结菌素肽的缀合。可以用于例如制备本公开的缀合物的非天然氨基酸包括具有选自以下中的官能团的那些：叠氮化物、炔烃、烯烃、氨基

　　氧基、肼、醛、硝酮、氧化腈、环丙烯、降冰片烯、异氰化物、芳基卤化物和硼酸官能团。可以被并入本公开的扭结菌素

　　药物缀合物的扭结菌素肽的非天然氨基酸(可以选择该非天然氨基酸以提供感兴趣的官能团)是已知的并且描述于例如maza等人(2015)bioconjug.chem.26(9):1884

　　具有与细胞表面分子结合的工程环的扭结菌素肽的开发方式可以变化。理性和组合方法已被用于设计具有新分子识别特性的扭结菌素。例如，可以创建和筛选扭结菌素蛋白的文库，例如通过细菌展示、噬菌体展示、酵母表面展示、荧光激活细胞分选(facs)和/或任何其他合适的筛选方法。

　　酵母表面展示是一种强有力的组合技术，其已用于工程化具有新的分子识别性质、增加的靶结合亲和力、适当折叠和改进的稳定性的蛋白质。在该平台中，以高通量方式生成和筛选蛋白质变体文库以分离具有所需生物化学和生物物理性质的突变体。酵母表面展示已被证明是一种成功的组合方法，可用于改造具有改变的分子识别的扭结菌素。酵母表面展示受益于真核分泌途径、伴侣辅助折叠和有效二硫键形成的质量控制机制。

　　用于开发具有与目标细胞表面分子结合的工程化环的一个示例性方法涉及将所述肽遗传融合至酵母交配凝集素蛋白aga2p，其通过两个二硫键与酵母细胞壁蛋白aga1p结合。该aga2p融合构建体和染色体整合的aga1p表达盒可以在合适的启动子(如半乳糖诱导型启动子)的控制下表达。可以包括n

　　端表位标记以通过使用荧光标记的初级或次级抗体的流式细胞术测量细胞表面表达水平。该构建体代表最广泛使用的展示形式，其中扭结菌素(或待改造的其他蛋白质)的n末端与aga2融合，但已描述了酵母表面展示质粒的几种可选变体并且可用于开发本公开的缀合物中使用的扭结菌素肽。与噬菌体或mrna展示所

　　用的基于淘选的方法相比，该筛选平台的一个优点是双色facs可用于定量区分对期望靶的结合亲和力差异小至两倍的克隆。

　　为了在dna水平上选择性地突变扭结菌素环区域，可以使用例如重叠延伸pcr通过寡核苷酸组装来引入简并密码子。接着，可以使用与酵母展示载体充分重叠的侧翼引物扩增遗传物质，用于在酵母中同源重组。这种组装和扩增方法允许以相对较低的成本和工作量创建扭结菌素库。已经开发了合成寡核苷酸文库和最新方法，其允许对文库组成进行确定的控制。

　　在某些方面，通过facs筛选展示文库(例如，酵母展示文库)用于与所关注的细胞表面分子结合。当通过facs筛选扭结菌素库时，通常在4

　　myc表位标签，另一种荧光标记用于测量扭结菌素突变与目标结合靶标的相互作用。不同的仪器激光器和/或滤光器组可用于以单细胞分辨率测量两种荧光团的激发和发射性质。这使得酵母表达水平能够用结合进行归一化。也就是说，表现出差的酵母表达但结合大量靶标的扭结菌素可以与高水平表达但与靶标弱结合的扭结菌素区分开。因此，表达对结合的二维流式细胞术图将导致与靶抗原结合的对角酵母细胞群体。可以使用文库分类门分离高亲和力的粘合剂。或者，在初始分类轮次中，清除不表达全长的不期望克隆的文库可能是有用的。筛选中使用的靶标在结构和功能上与最终应用相关，例如模拟感兴趣的细胞表面分子。

　　在为针对感兴趣的细胞表面分子的粘合剂富集扭结菌素文库后，回收酵母质粒并进行测序。可以在增加的分选严格性下执行更多轮facs。然后可以测量单个酵母展示的扭结菌素克隆的结合亲和力或动力学解离速率。

　　一旦通过表面展示(例如酵母表面展示)鉴定了具有与感兴趣的细胞表面分子结合的工程化环的扭结菌素肽，就可以使用合适的方法生产工程化扭结菌素。小尺寸的扭结菌素使其适合通过化学合成和重组表达二者进行生产。根据某些实施方案，扭结菌素肽可以通过固相肽合成随后体外折叠产生。化学合成允许将非天然氨基酸或其他化学处理轻松掺入到扭结菌素肽中。

　　未与大异源结构域融合的扭结菌素肽很容易在自动合成仪上使用固相肽化学合成。例如，可以使用标准的基于9

　　芴基甲氧基羰基(fmoc)的固相肽化学。然后可以在促进半胱氨酸侧链硫醇氧化形成二硫键的条件下折叠线性肽，然后进行纯化，例如通过反相高效液相色谱(rp

　　在某些方面，使用重组dna方法产生扭结菌素肽或包括与抗体亚基或其片段融合的扭结菌素肽的融合蛋白。可以采用在多种宿主细胞类型中使用重组方法产生扭结菌素肽或融合蛋白的任何合适的策略。例如，功能性扭结菌素已经用barnase作为遗传融合伴侣产生，其促进大肠杆菌周质空间中的折叠并且用作有用的纯化手柄。根据某些实施方案，工程化的扭结菌素肽在酵母中表达。例如，酵母菌株巴氏毕赤酵母(pichia pastoris)已成功用于生产2

　　10mg/l的纯化的工程化扭结菌素。酵母表达构建体可编码一个或多个标签(例如，用于通过例如金属螯合色谱(ni

　　本公开的方面包括编码在本公开的缀合物中使用的扭结菌素肽和融合蛋白的核酸。即，提供了编码本文所述的具有与感兴趣的细胞表面分子结合的工程化环的任何扭结

　　菌素肽和融合蛋白的核酸。在某些方面，此种核酸存在于表达载体中。表达载体包括与编码扭结菌素肽的核酸可操作地连接的启动子，该启动子基于选择用于表达扭结菌素肽的宿主细胞的类型进行选择。还提供了包含本公开的任何扭结菌素肽编码核酸的宿主细胞，以及包含其的任何表达载体。

　　使用直接结合或竞争结合测定来测量扭结菌素对细胞(例如，癌细胞，例如哺乳动物癌细胞)表面上表达的分子的亲和力的方法是可用的。在直接结合测定中，可以使用缀合至荧光团或放射性同位素的扭结菌素或含有n

　　)以供通过标记的抗体进行检测。如果标记或标签不可行或不是期望的，可以使用竞争结合试验来确定半数最大抑制浓度(ic

　　值。当在较低浓度范围内测量高亲和力相互作用时，配体耗竭将更为明显，并且可以通过减少实验中添加的细胞数量或通过增加结合反应体积来避免配体耗竭或使配体耗竭最小化。

　　在某些方面，扭结菌素肽或融合蛋白具有约0.01nm至100nm，例如约0.025nm至75nm、约0.05nm至50nm、约0.075nm至25nm或约0.1nm至10nm的细胞表面分子的平衡结合常数(k

　　)。在一些实施方案中，扭结菌素肽或融合蛋白具有约0.1nm至10nm的细胞表面分子的平衡结合常数(k

　　)。在一些实施方案中，扭结菌素肽或融合蛋白具有约0.1nm的细胞表面分子的平衡结合常数(k

　　)。在一些实施方案中，扭结菌素肽或融合蛋白具有约0.5nm的细胞表面分子的平衡结合常数(k

　　在moore,s.和cochran,j.(2012)engineering knottins as novel binding agents,methods in enzymology,503,223

　　251中描述了通过酵母表面展示技术工程化扭结菌素的详细指南和具体方案，其包括扭结菌素文库构建和筛选，以及通过化学合成和重组表达生产扭结菌素，以及进一步使用直接结合或竞争结合测定的用于测量扭结菌素与细胞表面上表达的分子(受体)的亲和力的细胞结合测定。

　　现有的靶向剂几乎完全依赖于高分子量(mw)蛋白质，即抗体，替代性低mw靶向蛋白质的潜力尚未开发。尽管有超过约100多种抗体

　　药物缀合物(adc)候选药物处于临床开发阶段，但只有四种adc获得了fda的批准重大障碍仍然阻碍了此类靶向治疗的临床成功。超过55种adc候选药物在临床试验中失败，其中至少23种失败是由于治疗窗口不佳。获批或处于后期临床开发阶段的adc基本上偏向于血液系统癌症，并且对实体瘤的临床成功率急剧下降。抗体的大分子量免疫球蛋白g(igg)部分面临着从血管有效外渗和在实体瘤中扩散的物理挑战。此外，adc的循环半衰期延长，最初被认为是完全有益的，因为它允许增加肿瘤中的绝对药物积累，也通过增加健康组织对完整缀合物和过早释放药物的暴露而导致脱靶毒性。

　　药物缀合物的历史局限性，所述局限性包括对实体瘤的疗效有限以及由于无法穿过血脑屏障而被排除在靶向脑肿瘤之外。尽管低mw靶向蛋白具有理论上的优势，但普遍认为此类靶向剂会因快速全

　　身清除或毒性而无效。然而，如本文所证明的，本公开的低mw靶向剂表现出出乎意料的高功效，例如抗肿瘤功效。

　　在低mw靶向剂的一个实例中，提供了缀合物，其包括包含与细胞表面分子结合的工程环的扭结菌素肽(包括但不限于上述的任何扭结菌素肽)和通过接头与扭结菌素肽缀合的抗微管剂。这种缀合物的非限制性实例示意性地示于图1中，小图b(右

　　如本文所用，“抗微管剂”是防止形成和/或破坏微管的试剂。微管是动态不稳定的细胞骨架蛋白聚合物，其对许多基本的哺乳动物细胞功能(包括细胞分裂、分化、运输和运动)至关重要。微管的生物学功能受αβ

　　微管蛋白。相反，gdp与gtp的交换再生了微管蛋白的活性形式，其通过gtp水解聚合的。因此，gtp

　　微管蛋白相互作用在微管动力学的细胞调节中起重要作用。由于它们对各种细胞功能的核心重要性，微管蛋白二聚体和微管细胞骨架是大量破坏有丝分裂的细胞毒剂的目标。

　　在某些实施方案中，与扭结菌素肽缀合的抗微管剂是微管蛋白抑制剂。根据一些实施方案，微管蛋白抑制剂是奥瑞他汀(auristatin)。可用于本公开的扭结菌素缀合物中的奥瑞他汀的非限制性实例包括奥瑞他汀e和奥瑞他汀f。在某些实施方案中，奥瑞他汀是单甲基奥瑞他汀f(mmaf)。根据一些实施方案，奥瑞他汀是单甲基奥瑞他汀e(mmae，其结构提供于图1，小图a)。mmae是一种多拉司他汀10衍生物，其活性优于其母体化合物，并且毒性增加。mmae包含四种氨基酸：单甲基缬氨酸(meval)、缬氨酸(val)、多莱索鲁因(dil)和多拉普林(dap)，以及羧基末端胺去甲麻黄碱。许多微管蛋白抑制剂根据它们结合的微管蛋白二聚体的一般区域进行了粗略的分类。mmae属于长春花位点抗有丝分裂剂的范畴。长春花位点抗有丝分裂剂通常结合在两个纵向排列的微管蛋白二聚体之间的界面上，在β1微管蛋白亚基和相邻的α2微管蛋白亚基之间，这是由经典生物碱微管不稳定剂(如长春碱和艾日布林)靶向的结构域。生物物理实验和晶体结构已被用来证实mmae结合了结构不同于长春花位点的区域，称为肽位点。mmae是一种有效的微管蛋白抑制剂，可与α/β微管蛋白界面附近的肽位点紧密结合，并有效阻止gtp水解并从而阻止其聚合。此外，最近显示mmae在自然无序的β

　　药物缀合物中，抗微管剂通过接头与扭结菌素肽缀合。可用于本发明的缀合物的接头的非限制性实例包括酯接头、酰胺接头、马来酰亚胺或马来酰亚胺基接头；缬氨酸

　　甲酸酯(smcc)接头；乙烯基砜基接头；包括聚乙二醇(peg)的接头，例如但不限于四甘醇；包括丙酸的接头；包括癸烯酸的接头，和包括其任何组合的接头。在某些方面，该接头是化学不稳定接头，诸如在中性ph(血流ph7.3

　　5.0)中时发生水解的酸可裂解接头。化学不稳定接头包括但不限于腙基接头、肟基接头、碳酸酯基接头、酯基接头等。根据某些实施方案，该接头是酶不稳定接头，诸如这样一种酶不稳定接头，其在血流中是稳定的，但在内化到靶细胞中时进行酶切(例如，通过靶细胞(例如，癌细胞)的溶酶体中的溶酶体蛋白酶(诸如组织蛋白酶或纤溶

　　pab)接头等。化学不稳定接头、酶不稳定的和不可切割的接头是已知的并且详细描述于例如ducrystump(2010)《生物共轭化学(bioconjugate chem.)》21:5

　　pab)接头(图1小图a中示意性说明)。在某些实施方案中，接头是缬氨酰丙氨酰对氨基苄氧基(val

　　抗体亚基缀合物。此类缀合物包括融合蛋白，该融合蛋白包括包含结合至细胞表面分子的工程化环的扭结菌素肽(包括但不限于上述任何扭结菌素肽)，其与抗体亚基或其片段融合。此类缀合物还包括通过接头与融合蛋白缀合的药物。在一些实施方案中，提供了此类缀合物的二聚体，其中抗体亚基或其片段二聚化(例如，通过铰链区(如果存在)处的二硫键桥等)以形成二聚化的扭结菌素药物缀合物。

　　根据一些实施方案，抗体亚基或其片段是抗体重链或其片段。在某些实施方案中，抗体重链或其片段包括γ、α、δ、ε或μ抗体重链或其片段。根据一些实施方案，抗体重链或其片段是igg重链或其片段，例如人igg1重链或其片段。在某些实施方案中，抗体重链或其片段包含重链可变区(v

　　)。这种抗体重链或其片段还可包括重链恒定区或其片段。例如，当融合蛋白中包括重链恒定区或其片段时，抗体重链恒定区或其片段可包括c

　　的抗体重链或其片段。这样的抗体重链或其片段可以包括、基本上由、或由fc区组成。可包含在本公开的任何含有重链(或其片段)的缀合物中的fc区的非限制性实例具有以下氨基酸序列：

　　当本公开的缀合物包括与抗体重链或其片段融合的扭结菌素肽时，扭结菌素肽可与抗体重链或其片段的n端融合。或者，可将扭结菌素肽融合到抗体重链或其片段的c端。

　　对于包括与抗体重链或其片段融合的扭结菌素肽的缀合物，药物可以与融合蛋白的扭结菌素肽部分缀合。或者，药物可与融合蛋白的抗体重链或其片段部分缀合。例如，当抗体重链或其片段包括、基本上由或由fc区组成时，药物可与fc区缀合。在这些实施方案

　　根据一些实施方案，抗体亚基或其片段是抗体轻链或其片段。在某些实施方案中，抗体轻链或其片段包括kappa(κ)轻链或其片段或lambda(λ)轻链或其片段。根据一些实施方案，抗体轻链或其片段包括轻链可变区(v

　　当本公开的缀合物包括与抗体轻链或其片段融合的扭结菌素肽时，扭结菌素肽可与抗体轻链或其片段的n末端融合。或者，可将扭结菌素肽融合到抗体轻链或其片段的c端。

　　对于包括与抗体轻链或其片段融合的扭结菌素肽的缀合物，药物可以与融合蛋白的扭结菌素肽部分缀合。或者，药物可与融合蛋白的抗体轻链或其片段部分缀合。例如，药物可缀合至v

　　在某些实施方案中，当本公开的缀合物包括融合至抗体亚基或其片段的扭结菌素肽时，所述抗体亚基或其片段包括重链可变区(v

　　不与细胞表面上的抗原结合，该细胞表面包括与扭结菌素的工程环结合的细胞表面分子。在某些实施方案中，当本公开的缀合物包括与包含重链可变区(v

　　包含与抗体亚基或其片段融合的扭结菌素肽的缀合物中使用的药物可以是任何合适的药剂，并且将根据使用缀合物的应用而变化，所述应用例如杀死、防止细胞增殖等。可包含在缀合物中的药物的限制性实例包括毒素、毒素片段、抗增殖剂、抗肿瘤剂等。在某些方面，缀合物包含通过抑制细胞增殖和/或杀死细胞/组织来降低靶细胞/组织功能的试剂。这种试剂可以变化，并且包含细胞抑制剂和细胞毒性剂，例如，能够杀死靶细胞组织，内化到或未内化到靶细胞中的试剂。

　　在一些实施方案中，缀合物的药物是细胞毒性剂，例如选自烯二炔、lexitropsin、duocarmycin、紫杉烷、嘌呤霉素、海兔毒素、美登木素生物碱和长春花生物碱的细胞毒性剂。根据某些实施方案，细胞毒性剂是紫杉醇、多西紫杉醇、cc

　　内皮抑素融合蛋白)、mmae(单甲基尿嘧啶e)、mmaf(单甲基尿嘧啶f)、吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)、五加素、纺锤菌素或其任何组合。

　　根据某些实施方案，缀合物的药物是选自半胱氨酸和哈米特林(hemiasterlin)类似物如hti

　　286的蛋白质毒素(例如，参见uspn 7,579,323；wo 2004/026293；和uspn 8,129,407，其全部公开内容通过引用并入本文)、相思子毒素(abrin)、布鲁辛(brucine)、毒芹素(cicutoxin)、白喉毒素、蟾毒素(batrachotoxin)、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、falcarinol、伏马菌素b1、伏马菌素b2、阿夫罗毒素、毛蕊素、agitoxin、charybdotoxin、马拉毒素、树懒毒素、锡拉毒素、河豚毒素、钙化脓毒毒素、泰卡毒素、calcicludine、格尔达那霉素、格洛宁、洛塔菌素、ocratoxin a、棒曲霉素、蓖麻毒素、马钱子碱、三氯乙烯、玉米烯酮

　　和四点毒素。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白a链、相思子毒素a链、蒴莲素a链、α

　　帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(phytolaca americana)蛋白(papi、papii和pap

　　s)、苦瓜苦参碱抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。

　　在某些实施方案中，缀合物的药物选自抗微管剂、微管蛋白抑制剂、奥瑞他汀、奥瑞他汀e、奥瑞他汀f、单甲基奥瑞他汀e(mmae)、单甲基奥瑞他汀f(mmaf)、奥瑞他汀w衍生物、美登素、美登素衍生物、n2’

　　美登素(dm1)、ravtansine(dm4)、吡咯并苯并二氮类(pbd)、加利车霉素、duocarmycin、多柔比星、sn

　　根据一些实施方案，缀合物的药物是核苷药物。这种核苷药物可以是核苷类似物。可采用的核苷类似物的非限制性实例包括吉西他滨、阿糖胞苷、曲沙他滨、地西他滨、克拉屈滨、氟达拉滨、氯法拉滨和2

　　可以在包括与抗体重链或其片段融合的扭结菌素肽的缀合物中使用任何合适的接头。此类接头的非限制性实例在与扭结菌素

　　药物缀合物相关的前述部分中进行了描述，出于简洁的目的，该描述被并入此处但未在此重复。在某些实施方案中，包含与抗体重链或其片段融合的扭结菌素肽的缀合物包括接头，所述接头包含缬氨酸

　　pab)接头(图1小图a中示意性说明)。在某些实施方案中，接头是缬氨酰丙氨酰对氨基苄氧基(val

　　抗体亚基缀合物的情况下将药物与扭结菌素肽或抗体亚基或其片段缀合。在一些实施方案中，该方法包括将药物位点特异性地缀合至扭结菌素肽或抗体亚基或其片段。例如，缀合可以包括将药物位点特异性地缀合至扭结菌素肽或抗体亚基或其片段的预先选定氨基酸。在某些方面，所述预先选定的氨基酸位于扭结菌素肽或抗体亚基或其片段的n端或c端。在其他方面，预先选定的氨基酸在扭结菌素肽或抗体亚基或其片段的内部，即，在扭结菌素肽或抗体亚基或其片段的n端和c端氨基酸之间。在一些实施方案中，所述预先选定的氨基酸是非天然氨基酸。可以提供给扭结菌素肽或抗体亚基或其片段以促进缀合的非天然氨基酸的非限制性实例包括具有选自以下中的官能团的那些：叠氮化物、炔烃、烯烃、氨基

　　氧基、肼、醛(例如，甲酰甘氨酸，例如，来自康泰伦特药业(catalent pharma solutions)的smartag

　　技术)、硝酮、氧化腈、环丙烯、降冰片烯、异氰化物、芳基卤化物和硼酸官能团。可以掺入和选择以提供目标官能团的非天然氨基酸是已知的并且描述于例如maza等人(2015)《生物共轭化学(bioconjug.chem.)》26(9):1884

　　9、patterson等人(2014)《acs化学生物学(acs chem.biol.)》9:592

　　605、adumeau等人(2016)《分子成像和生物学(mol.imaging biol.)》(2):153

　　许多策略可用于通过接头将药物和扭结菌素肽或抗体亚基或其片段缀合。例如，可以通过将接头共价连接至药物来衍生所述药物，其中接头具有能够与扭结菌素肽或抗体

　　亚基或其片段上的“化学柄”反应的官能团。还举例来说，扭结菌素肽或抗体亚基或其片段可以通过将接头共价连接到扭结菌素肽或抗体亚基或其片段而衍生化，其中接头具有能够与在药物上的“化学柄”反应的官能团。接头上的官能团可以变化，并且可以基于与药物或扭结菌素肽或抗体亚基或其片段上的化学柄的相容性来选择。根据一个实施方案，通过将具有化学柄的非天然氨基酸掺入药物或扭结菌素肽或抗体亚基或其片段中来提供化学柄。在一些实施方案中，通过无铜、应变促进的环加成、炔

　　如上所述，本公开提供了组合物。所述组合物可以包括本公开的任何缀合物，包括在以上缀合物部分中描述的任何缀合物，为了简洁起见，将其并入此处但不再重复。

　　在某些方面，组合物包含存在于液体介质中的本公开的缀合物。液体介质可以是水性液体介质，诸如水、缓冲溶液等。一种或多种添加剂诸如盐(例如，nacl、mgcl2、kcl、mgso4)、缓冲剂(tris缓冲剂、n

　　还提供了药物组合物。药物组合物包含本公开的任何缀合物和药学上可接受的载体。药物组合物通常包含治疗有效量的缀合物。“治疗有效量”是指足以产生期望的结果的剂量，例如，足以产生有益的或期望的治疗(包括预防性)结果的量，诸如患有与工程环结合的细胞表面分子相关联的细胞增殖性病症(例如，癌症)的个体中的细胞增殖减少等。有效量可以在一次或多次施用中施用。

　　本公开的缀合物可以掺入各种用于治疗性施用的制剂中。更特别地，缀合物可以通过与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液剂、注射剂、吸入剂和喷雾剂。

　　适于对个体给药(例如，适于人给药)的本公开的缀合物的制剂通常是无菌的，并且还可以不含可检测的致热原或根据所选择的给药路径对个体给药禁忌的其它污染物。

　　在药物剂型中，缀合物可以单独给药或适当联合给药，以及与其它药物活性化合物联合给药。以下方法和赋形剂仅仅是实例，而绝不是限制性的。

　　对于口服制剂，缀合物可单独使用或与适当的添加剂组合使用，以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，与常规添加剂，如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；与粘合剂，如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；与润滑剂，如滑石或硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂组合使用。

　　可以将缀合物配制成制剂，通过将所述制剂溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(诸如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中进行注射；并且如果需要，可以使用常规添加剂，诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。

　　药物组合物可以是液体形式、冻干形式或由冻干形式重构的液体形式，其中冻干制剂在给药前用无菌溶液重构。重构冻干组合物的标准程序是加回一定体积的纯水(通常相当于冻干期间移除的体积)；然而，包括抗菌剂的溶液可以用于产生用于肠胃外施用的药

　　缀合物的水性制剂可以在ph缓冲溶液中制备，例如，在约4.0至约8.0、诸如约4.5至约7.5、例如约5.0至约7.0的ph范围内。适于此范围内的ph的缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和其它有机酸缓冲剂。缓冲液浓度可以为约1mm到约100mm或约5mm到约50mm，这取决于例如缓冲液和制剂的所需张力。

　　如上所述，还提供了使用本公开的缀合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用以上缀合物部分中描述的任何缀合物，为了简洁起见，将其并入此处但不再重复。

　　在一些实施方案中，提供的方法包括对有需要的个体给药治疗有效量的本公开的任何缀合物或任何药物组合物。在一些实施方案中，个体患有癌症并且工程化环与个体中存在的癌细胞上的细胞表面分子结合。因此，本公开内容的方面包括通过向患有癌症的个体施用治疗有效量的本公开的任何缀合物或任何药物组合物来治疗癌症的方法。根据该主题方法，可以治疗各种各样的个体。通常这样的受试者是“哺乳动物”或“哺乳动物的”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物纲内的生物体，包括食肉目(例如，狗和猫)，啮齿类(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类(例如，人、黑猩猩和猴)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体是动物模型，例如小鼠模型。

　　在一些实施方案中，缀合物(或包括该缀合物的药物组合物)的有效量是这样的量，与没有用缀合物或药物组合物治疗的个体中的症状相比，当单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种另外的治疗剂组合(例如，在组合疗法中)以一个或多个剂量给药时，该量有效地将个体的医学病状(例如，癌症等)的症状降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。

　　在一些实施方案中，个体患有以存在实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等为特征的癌症。在一些实施方案中，个体患有选自以下中的癌症：乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、白血病(例如，急性髓性白血病(aml))、肝癌(例如，肝细胞癌(hcc)，诸如原发性或复发性hcc)、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、甲状腺癌、它们的任何组合以及它们的任何亚型。

　　[0137]“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指至少改善与个体的医学病状(例如，细胞增殖性疾病，例如，癌症)相关联的症状，其中改善在广义上用于指至少降低与所治疗的医学病状相关联的参数，例如症状的大小。因此，治疗还包括医学病状或至少与其相关联的症状被完全抑制(例如，防止发生)或停止(例如，终止)的状况，使得个体不再患有该医学病状，或至少不再患有表征该医学病状的症状。

　　缀合物或药物组合物可以使用适于药物递送的任何可用方法和路径给药于个体，包括体内和体外方法，以及全身和局部给药路径。常规和药学上可接受的给药路径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部应用、眼内、静脉内、动脉内、鼻、口服和其它肠内和肠胃外给药路径。在一些实施方案中，给药通过肠胃外给药进行。如果需要，可以组合施用途径，或根据缀合物和/或所需效果调节施用途径。缀合物或药物组合物可以以单个剂量或多个剂量给药。在一些实施方案中，缀合物或药物组合物静脉内给药。在一些实施方案中，缀合

　　在一些实施方案中，个体患有实体瘤。在一些实施方案中，当个体患有实体瘤时，该方法包括向个体施用本公开的扭结菌素

　　药物缀合物(kdc)。如本文所证明的，与更高分子量的靶向剂相比，此类缀合物表现出出乎意料的有益渗透到实体瘤中。

　　在一些实施方案中，个体患有癌症，其治疗需要缀合物穿过血脑屏障(bbb)。这种癌症的非限制性实例是脑肿瘤，例如，胶质母细胞瘤等。在一些实施方案中，当个体患有癌症而其治疗需要缀合物穿过bbb时，该方法包括向个体施用本公开的低分子量缀合物，例如本公开的扭结菌素

　　本公开的方面还包括试剂盒。在一些实施方案中，主题试剂盒包括本公开的任何缀合物(包括上文缀合物部分中描述的任何缀合物，出于简洁的目的将其并入此处但不再重复)或包含它们的药物组合物，以及用于向有需要的个体施用药物组合物的说明书。

　　在一些实施方案中，缀合物或药物组合物以一种或多种(例如，两种或更多种)单位剂量存在。如本文中所使用的，术语“单位剂量”是指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位包含按足以产生期望效果的量计算的预定量的缀合物或组合物。单位剂量的量取决于各种因素，例如所用的特定缀合物、要实现的效果和个体中与缀合物相关的药效学。在其它实施方案中，试剂盒可以包括单一多剂量的量的缀合物或药物组合物。

　　试剂盒中所包括在说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即与包装或次包装有关联)等。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，便携式闪存驱动器、dvd、cd

　　rom、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在其它实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于从远程源(例如经由因特网)获得说明书的方式。该实施方案的一个实例是包括网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的方式被记录在合适的基材上。

　　5.根据实施方案4所述的缀合物，其中所述微管蛋白抑制剂是单甲基奥瑞他汀e(mmae)或者单甲基奥瑞他汀f(mmaf)。

　　13.根据实施方案12所述的缀合物，其中所述抗体重链或其片段包含γ、α、δ、ε或μ抗体重链或其片段。

　　17.根据实施方案16所述的缀合物，其中所述抗体重链或其片段进一步包含重链恒定区或其片段。

　　28.根据实施方案27所述的缀合物，其中所述抗体重链或其片段包含fc区，并且其中所述药物与所述fc区缀合。

　　32.根据实施方案31所述的缀合物，其中所述抗体轻链或其片段是kappa(κ)轻链或其片段。

　　33.根据实施方案31所述的缀合物，其中所述抗体轻链或其片段是lambda(λ)轻链或其片段。

　　47.根据实施方案46所述的缀合物，其中所述微管蛋白抑制剂是单甲基奥瑞他汀e(mmae)或者单甲基奥瑞他汀f(mmaf)。

　　62.根据实施方案60所述的缀合物，其中所述整联蛋白选自：αvβ1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白、α5β1整联蛋白，以及它们的任意组合。

　　67.根据实施方案66所述的缀合物，其中所述免疫细胞受体是细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla

　　78.根据实施方案77所述的方法，其中所述个体患有癌症并且所述工程环与所述个体中存在的癌细胞上的细胞表面分子结合。

　　82.根据实施方案81所述的方法，其中所述整联蛋白选自：αvβ1整联蛋白、αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、αvβ6整联蛋白、α5β1整联蛋白，以及它们的任意组合。

　　ab融合(kab)(图1b)。该扭结菌素基于之前设计的扭结菌素eeti 2.5f，并进行了修改以方便浓度测量(图2)。通过固相肽合成然后折叠和纯化来生产扭结菌素肽。然后将eeti 2.5f基因融合到人igg1 fc结构域以形成kfc，并基因融合到全长人igg1抗体的n端以对抗无关的结合靶标(抗fitc或抗人cea)以形成kab。

　　药物缀合物(kdc)(图3、4)。通过醛标记的kfc或kab与hips接头mmae衍生物的hydrazino

　　使用u87mg成胶质细胞瘤细胞测量实施例1中描述的构建体的结合亲和力。使用alexa fluor 488缀合的蛋白直接测量无药物蛋白亲和力，并通过竞争结合测定法代替alexa fluor 488标记的k来测量药物缀合物。所有测试的构建体都以低纳摩尔亲和力与u87mg细胞结合(图9a

　　b)。测量的亲和力与之前的研究一致，表明与fc或ab的基因融合以及与mmae的缀合都不会明显干扰扭结菌素的肿瘤靶向。

　　pab接头的裂解以及mmae的随后释放和作用机制取决于细胞内递送。因此，重要的是验证每个构建体是否有效地内化。通过将alexa fluor 488缀合蛋白与细胞在37℃下温育来测量内化。温育4小时后，使用抗af488抗体淬灭表面结合的蛋白质，该抗体结合任何暴露的荧光团。如图10a所示，如果通过在4℃下温育细胞以冻结质膜来抑制内化，则

　　所有构建体均显示出高于对照的显著内化(图10b)。每种化合物的相对内化从最小到最大依次为k、kfc，然后是kab。为了确定双价是否是导致kfc比k内化增加的主要原因，测试了单价1臂kfc。这种单价fc显示出类似的内化(图10c)，表明价态不是增加内化的主要驱动因素。受限的fc铰链区可能限制了kfc充分利用二价相互作用或聚集多个整合蛋白对的能力。相反，kab在扭结菌素之间具有更大的灵活性。构建了一种抗体

　　扭结菌素(abk)构建体，其中eeti 2.5f基因融合到c端而不是n端，用于测试限制扭结菌素间距离和灵活性是否会降低内化。如图10d所示，abk具有与kfc相似的内化水平，表明kab更容易能够结合并聚集多个整联蛋白对。

　　因为kfc和abk都比k更容易内化，所以假设fc可以通过fc受体或补体介导的途径促进内化。k、kfc和kab的内化在热变性培养基以及pbs和0.1％牛血清白蛋白的缓冲液中进行测试(图11)。与在完全培养基中温育的那些相比，在热变性培养基或pbs中温育的构建体均未显著降低内化，这表明培养基中的活性蛋白(c1q等)对kfc和kab的内化增加没有明显贡献。然后测量每种k、kfc、单价kfc和kab的内化速率，并与这些构建体在fc阻断蛋白或过量未缀合k存在下与细胞一起温育时进行比较(图12)。

　　通过测量u87mg细胞生长的抑制来测试每种药物缀合物的体外功效(图13)。未缀合的蛋白质耐受性良好并且当剂量高达100nm时不会诱导显著的细胞死亡(图13a

　　为了在更能代表体内治疗的模型中评估每种药物缀合物的活性，建立了类似的测定，将表达rfp的u87mg细胞与sytox绿一起温育，并且每4小时成像一次。在几个时间点后，洗涤细胞并用新鲜的含药物培养基或新鲜的不含药物的培养基替换培养基(图14)。所有缀合物仅在暴露24小时后就保持高效力并抑制增殖(图14b)。进一步研究了每种药物缀合物抑制增殖的能力以揭示kdc仅在暴露3小时后继续表现出完全的细胞抑制(图14c)。细胞增殖的抑制反映了测量的细胞毒性。当在不洗涤、洗涤含药物培养基或洗涤24小时后培养时，所有缀合物均诱导几乎100％的细胞死亡(图14d、14e)。每个构建体也在更严格的条件下进行评估，其中在暴露3小时后进行洗涤。kdc保持有效的活性并导致95％的细胞增殖抑制(图15)。kfdc和kadc各自的效力显著降低，各自抑制了约50％的细胞增殖。

　　通过向携带u87mg胶质母细胞瘤髋关节异种移植物的小鼠静脉注射alexa fluor 680缀合蛋白来评估每种药物缀合物在体内靶向肿瘤的能力(图16)。使用ivis光谱通过非侵入性近红外荧光成像监测荧光。在每个时间点，计算在肿瘤上感兴趣区域和另一个对照roi的辐射效率，以近似血液中荧光标记的药物缀合物的β半衰期，并将其与保留的肿瘤信号进行比较。

　　肿瘤靶向载体的药代动力学特征部分取决于大小。低于肾小球滤过尺寸截止值的低mw载体(文献中通常报道为～70kda)更有可能通过肾脏过滤快速消除。kdc(～5kda)远低于肾清除截止值并且具有1.4小时的β半衰期，表明肾清除速度快(图17a)。kfdc(～65kda)的mw接近于肾清除截止值并且具有17.7小时的β半衰期，可能通过fc介导的半衰期延长而额外延长(图17b)。kadc(～150kda)具有最长的测得的β半衰期，为25.3小时(图17c)。在每

　　个缀合物中，肿瘤信号显著高于背景并且在背景信号返回到基线后持续存在。对于kdc，在给药后3

　　5小时观察到最大肿瘤与背景比(图17d)。kfdc在给药后大约10小时获得最大的肿瘤与背景比率，并在数天内保持高比率(图17e)。kadc保持适度的肿瘤与背景比率，该比率持续甚至增加超过一周(图17f)。

　　为了进一步评估肿瘤与背景的比率，对每个器官对荧光标记的药物缀合物的吸收进行了体外测量。带有u87mg胶质母细胞瘤髋关节异种移植物的裸鼠被静脉注射alexa fluor680缀合蛋白。3或24小时后处死小鼠，取出器官进行成像。切除肿瘤的辐射效率显著高于所有其他测量器官。具体而言，肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、心脏、肺、膀胱、股四头肌和股骨(图18)。值得注意的是，这些离体数据证实了kdc被肾脏过滤而kadc在肝脏中代谢并且kfdc介于这两者之间的假设。kadc显示出明显高于kfdc或kdc的肝脏摄取，尽管仍是30％的肿瘤中信号。kdc具有较高的肾脏和膀胱摄取，表明通过肾脏过滤清除和尿液中消除。

　　u87mg体外增殖的高亲和力结合、快速内化和有效抑制表明，每种药物缀合物在小鼠模型中具有显著潜力。成像和药代动力学数据证实kdc的循环半衰期很短，而kfdc，尤其是kadc在血液中持续数天。因此，建立了体内治疗功效研究以评估每种药物缀合物的性能。

　　当以5mg/kg每周给药3次时，mmaf缀合的kfdc具有中等疗效(数据未显示)。使用该治疗方案作为起点，每个治疗组使用5只小鼠进行了初步研究。用5x106个u87mg细胞在小鼠右侧接种小鼠，使肿瘤生长并形成，直至达到大约30mm2的面积。然后将小鼠随机分到4个治疗组的1组：pbs、kdc、kfdc或kadc。尽管kdc的循环半衰期短，但为了保持各组等效并为kdc提供最高的疗效机会，所有药物缀合物组每周给药3次，持续3周。每个剂量包含适当的药物缀合物，归一化为2.38nmol mmae(～0.6mg/kg kdc、～5mg/kg kfdc、～10mg/kg kadc)。

　　与对照小鼠相比，所有药物缀合物显著延长了存活期(图19a、19b)。kdc在5只小鼠中的1只中诱导肿瘤完全消退，并在5只小鼠中的其余4只中保持细胞生长抑制作用(图19c)。治疗3周后，这4只小鼠的肿瘤复发了。kfdc和kadc均导致每个治疗组的所有5只小鼠的肿瘤完全消退(图19c)。在实验期间还记录了所有小鼠的体重以监测严重毒性的迹象。所有组的重量无法区分，表明化合物具有良好的耐受性(图19d)。

　　图19中的数据证明所有药物缀合物都能够产生治疗效果。为了进一步研究每种化合物，对实验设计进行了一些更改。由于kdc的快速全身清除，注射剂量的很大一部分可能丢失，因此约0.6mg/kg的剂量显著增加。因为化学治疗剂的剂量通常被确定为每个患者体表面积的化学治疗剂质量，所以选择等质量的更临床相关的比较而不是等摩尔比较。接下来，选择每周一次的给药方案以符合现实的临床给药考虑。最后，用matrigel基质植入肿瘤以增加肿瘤生长并且每次注射仅2.5x106个细胞以减少初始肿瘤坏死。携带u87mg髋关节异种移植物的小鼠被平均分配到以下治疗组中，每周一次静脉注射，持续4周：kdc、kfdc、kadc、未缀合蛋白或pbs对照。还在低剂量和高剂量下评估了每种药物缀合物。

　　低剂量的kdc(1mg/kg)的表现与中试实验相似，尽管进行了优化以允许更具侵袭性的肿瘤生长(图20a、20b)。给药1mg/kg的kdc显著延迟了肿瘤生长，但在治疗结束后5只小鼠中有5只不引起肿瘤消退和肿瘤重新生长(图20c)。高剂量的kdc(5mg/kg)非常有效并且在5只小鼠中的4只中引起肿瘤完全消退并且在其余小鼠中显著延迟肿瘤生长(图20c)。用未缀合k处理的小鼠与pbs对照小鼠无法区分。

　　与中试实验相比，kfdc和kadc在更具侵袭性的肿瘤模型中的功效显著降低。低剂量的kfdc(5mg/kg)适度抑制肿瘤生长(图21a、21b)并在5只小鼠中的1只中引起肿瘤消退。在5只小鼠中的其余4只中，肿瘤生长减慢但并未停止(图21c)。高剂量的kfdc(10mg/kg)在5只小鼠中的2只中引起肿瘤完全消退并在5只小鼠中的其余3只中显著延迟肿瘤生长(图21c)。用未缀合kfc处理的小鼠与pbs对照小鼠无法区分。

　　低剂量的kadc(5mg/kg)是最低限度的有效(图22a、22b)。在5只小鼠中的5只中，肿瘤生长仅略微减慢(图22c)。高剂量的kadc(10mg/kg)也缺乏显著功效(图22a、22b)并且在所有小鼠中适度减缓肿瘤生长但不诱导任何肿瘤消退(图22c)。用未缀合kab(抗cea)处理的小鼠与pbs对照小鼠无法区分。

　　当使用每千克小鼠体重的药物缀合物质量的临床相关比较来比较药物缀合物时，kdc显著优于kfdc和kadc(图23)。为了了解这些结果与中试研究之间的差异，还用高得多剂量的30mg/kg施用的kadc治疗小鼠，这更接近等摩尔剂量的mmae。在该实验中，kadc非常有效并且在5只小鼠中的5只中诱导了完全的肿瘤消退(图24)。

　　在更具侵袭性的肿瘤模型中观察到的kadc功效的降低表明缺乏均匀的肿瘤递送，因为已知adc在实体瘤(ref)中的肿瘤渗透有限。cilliers等人在2018年证明，adc缺乏肿瘤渗透可以通过与未缀合抗体共同施用以竞争靶标结合位点来改善。为了验证向实体瘤的异质递送是解释kadc疗效有限的一个重要因素的假设，接下来用10mg/kg kadc和20mg/kg未缀合kab的组合对小鼠进行治疗，以饱和整联蛋白受体并促进kadc的肿瘤渗透增加。这种联合治疗显著提高了10mg/kg kadc的有效性，与用更高浓度的kadc治疗相当(图25)。

　　尽管kdc具有令人印象深刻的体内功效，但鉴于其快速肾脏过滤和高摩尔剂量的mmae，存在潜在的急性毒性问题。尽管在接受治疗的小鼠中没有观察到体重减轻，但有必要更严格地评估接受治疗的小鼠的器官健康状况。经过60天的实验，从治疗过的小鼠身上收获肝脏和肾脏，固定在4％多聚甲醛(pfa)中，然后埋入石蜡块中进行组织切片。切片用苏木精和伊红染色以显示细胞结构，并由独立的病理学家评分以获得急性毒性的证据。图26中所示的代表性图像都没有毒性指标，并且所有样品的评分与健康小鼠相同。

　　预计静脉内给药疗法的理论实体瘤吸收受两个主要因素的影响：循环半衰期和扩散到肿瘤块中。如上述实施例3所示，每种药物缀合物的半衰期与mw的预期一致。因此假设观察到的功效差异的主要因素是每个构建体的扩散性。

　　尽管肿瘤吸收率高，但已知抗体和其他大构建体具有较差的扩散性和异质性肿瘤吸收。大量肿瘤靶向抗体已显示在最靠近肿瘤脉管系统的肿瘤周围积聚。在血管外渗时，实体瘤内的均匀分布取决于扩散性和外周细胞内化率。如图27a

　　c所示，体内治疗研究的结果解释了每个构建体的预测扩散性。由于kdc快速扩散到实体瘤中，其较慢的内化率以及仅短暂暴露后的效力，该构建体能够最有效地治疗实体瘤。kfdc具有较慢的扩散和较快的内化速率，与其观察到的体内效力适度降低一致。最大的构建体kadc具有最低的扩散率和最快的内化率，因此在测试条件下表现最差。

　　该假设机制还解释了将kadc的剂量增加至30mg/kg或将kadc与未缀合的kab共同施用的效果(图27d)。根据该提议的机制，添加额外的kadc或kab会对疗效产生类似的影响。在每种情况下，增加的血浆浓度导致更高的血管周围浓度，并通过结合更高比例的可用整

　　合蛋白受体而有效降低外周肿瘤细胞的内化。不管额外的蛋白质是否与mmae缀合，肿瘤外围可用整合蛋白受体的饱和度增加使得kadc能够更均匀地扩散远离脉管系统。

　　为了验证这种机制，构建了体外装置来测试和可视化实体瘤扩散的差异。将表达rfp的u87mg胶质母细胞瘤细胞的实体肿瘤球体在超低粘附96孔板中生长。将球体生长至直径达到～750μm，然后用200nm af488标记的kdc、kfdc或kadc处理并温育4小时。然后使用共聚焦显微镜在100μm的深度对每个球体的光学切片进行成像，以可视化每个球体内标记蛋白质的相对强度。如图28a所示，红色通道对照强度在所有组中是一致的，而绿色通道强度在用af488

　　kdc处理的球体中心显著更高。这些数据提供了定性的视觉确认，即kdc在扩散到实体瘤块方面更有效。

　　为了获得更定量的比较，将绿色通道强度的相对衰减与来自本构表达的rfp的红色通道强度进行比较。因为由于稳定rfp表达而红色通道应该是均匀的，并且仅被球体的光密度衰减，因此该信号强度用于校正绿色通道的信号强度。图29显示使用这种校正，用af488

　　kdc处理的球体的真实强度在整个球体中是均匀的，并且该药物缀合物实现了均匀靶向，而kfdc和kadc具有显著的信号衰减。此外，对于所有缀合物，每个球体的总荧光强度相等(图29f)，进一步表明kdc均匀扩散到球体中，而kfdc和kadc更高度地集中在球体的外围。

　　kadc和未缀合的k或kab以结合受体，进一步研究了该机制。当与等摩尔k或kab一起温育时，af488

　　在图28和图29中的结果得到了多个独立试验的多次重复的证实。然而，为了进一步验证这一发现并确保结果不是由于成像伪影，球体再次以相同的方式与荧光标记的蛋白质一起温育，并在多个z高度成像以将信号下降可视化为深度的函数。如图30所示，与用kfdc或kadc处理的球体相比，在每个光学切片中心的绿色强度在用kdc处理的球体中保持相对恒定，其中信号衰减更为明显。

　　接下来，对该体外模型进行了修改，以测试除了共聚焦成像实验之外，是否可以看到类似的细胞杀伤。将球体用药物缀合物或mmae在一定浓度范围内进行处理。与药物缀合物温育5天后，将培养基更换为含有sytox绿的新鲜培养基。将biotek synergy h4微量滴定板读数器测量的荧光与用裂解缓冲液处理的球体进行比较。在100nm时，kdc显示出比kfdc、kadc或mmae明显更多的杀伤(图31)。为了可视化这种随时间的杀伤，每4小时使用incucyte对用50或100nm药物缀合物或mmae处理的球体进行成像。确认读板器测定的结果，kdc是高度有效的并且达到～100％球体毒性，而kadc的功效显著降低(图32a、32b)。此外，当与药物缀合物加未缀合的扭结菌素共同施用时，kfdc和kadc具有显著增加的效力，而kdc在添加或不添加未缀合的扭结菌素的情况下等效有效(图32c、32d)。

　　固相肽合成用于在rink酰胺树脂上使用标准fmoc条件合成扭结菌素肽，如第3章所述。用非天然氨基酸5

　　正缬氨酸代替2.5f的位置15处的丝氨酸合成了2.5f的修饰版本，称为3cm，以提供用于药物附着的缀合位点。如前所述进行肽裂解、折叠和hplc纯化。肽包含c端酰胺，与使用rink酰胺作为固体支持物一致。

　　mmae(1.2eq,1.2umol)在50％dmso/50％pbs中反应，使得反应混合物的最终浓度相对于3cm为0.62mm。使用圆底烧瓶作为反应容器并在40℃油浴中搅拌加热两天。

　　通过在15ml falcon管中以3500xg离心5分钟去除痕量固体，然后通过ptfe注射式过滤器过滤。此时，使用半制备型c18柱(zorbax eclipse xdb

　　q纯化水+0.1％tfa；溶剂b：乙腈+0.1％tfa)。纯化方法包括在30％溶剂b下等度保持2分钟，然后在30分钟内从30％到100％溶剂b的线分钟之间洗脱。lc

　　ms方法包括在30％溶剂b下等度保持2分钟，然后在15分钟内从30％到100％溶剂b的线性梯度。通过基于m/z值的低分辨率(esi

　　ms实验在与6120四极杆ms和peak scientific nm32la氮气发生器相连的agilent technologies 1260infinity上进行。使用agilent infinitylab poroshell 120ec

　　q纯化水+0.1％tfa；溶剂b：乙腈+0.1％tfa)。使用二极管阵列检测器监测210和280nm的波长。使用lc/msd化学工作站(安捷伦科技)处理和分析数据。

　　u87mg胶质母细胞瘤细胞获自美国典型培养物保藏中心(manassas,va)。红色荧光蛋白转染的u87mg细胞获自angioprotomie(boston,ma)。将细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素

　　104个细胞与整合蛋白结合缓冲液(ibb；25mm tris ph 7.4、150mm nacl、2mm cacl2、1mm mgcl2、1mm mncl2和0.1％牛血清白蛋白(bsa))中的不同浓度(0.01

　　200nm)alexa fluor 488标记蛋白质在4℃下温育3小时，以最大限度地减少内化。将细胞沉淀并用800μl pbsa(含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水)洗涤两次，并使用guava easycyte 8ht仪器(emd millipore)通过流式细胞术测量剩余表面结合蛋白的荧光。使用flowjo软件(treestar inc)评估所得数据，并使用prism软件(graphpad)确定平衡解离常数(kd)。误差棒代表一式三份进行的实验标准偏差。

　　104个细胞与作为竞争剂的1nm的alexa fluor 488标记的扭结菌素和不同浓度(0.01

　　500nm)的kdc、kfdc或kadc在ibb中在4℃下温育3小时以最小化内化。将细胞沉淀并用800μl pbsa(含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水)洗涤两次，并使用guava easycyte 8ht仪器(emd millipore)通过流式细胞术测量剩余表面结合蛋白的荧光。使用flowjo软件(treestar inc)评估所得数据，并使用prism软件(graphpad)确定平衡解离常数(kd)。误差棒代表一式三份进行的实验标准偏差。

　　104个细胞的密度接种在24孔板(corning)中。在让细胞沉降4小时后，将培养基更换为含有200nm alexa fluor 488标记蛋白并补充有1mm mncl2的新鲜培养基。然后将细胞在37℃下温育4小时。细胞用500μl pbs洗涤，并使用20μl 0.05％胰蛋白酶/edta分离。中和胰蛋白酶并将每个孔转移到eppendorf管中后，用800μl冷pbsa洗涤细胞。接下来，将细胞沉淀并在冰上重悬于50μl 1:200稀释的抗alexa fluor 488抗体(invitrogen)中，以淬灭表面结合的蛋白质。用800μl pbsa再次洗涤细胞，并如上所述通过流式细胞术测量内化蛋白的荧光。

　　103个细胞的密度接种在96孔板(corning)中并生长过夜。然后用100μl含有不同浓度kdc、kfdc、kadc或mmae的新鲜培养基处理细胞并温育4天。使用dokindo cell counting kit

　　8通过用100μl含有10％wst8的培养基替换每个孔中的培养基来测量细胞增殖。在37℃下温育1小时后，使用biotek synergy h4微孔板读数器测量450nm处的吸光度(a)。从所有样品中减去单独的cck

　　8的背景信号。然后将细胞增殖表示为相对于未处理细胞对照的吸光度百分比，如下所示。使用graphpad prism进行非线]

　　103个细胞的密度接种在96孔板(corning)中并生长过夜。然后用200μl含有10nm cytox green(thermofisher)和kdc、kfdc、kadc或mmae的新鲜培养基处理细胞，ed

　　约为10nm，或饱和浓度为100nm。将细胞在incucyte s3活细胞分析系统中温育5天，每4小时收集一次图像。对于洗涤条件，在3小时或24小时后，将培养基更换为新鲜的含药物培养基或新鲜的不含药物的培养基。

　　g离心10分钟而形成。将球体生长4天，直到直径达到750μm。然后将球体在含有200nm alexa fluor 488缀合的kdc、kfdc或kadc的新鲜培养基中温育4小时。温育后，将球体在pbs中洗涤并转移到falcon透明底部聚苯乙烯微孔板(corning)中。使用倒置lsm 780多光子激光扫描共聚焦显微镜(zeiss)对球体进行成像。显示的图像是在距球体底部100μm深度处拍摄的共焦切片。使用fiji图像分析软件进行定量。强度是从每个球体的中心径向计算的，并绘制为绿色强度的相对比率，对其针对作为衰减对照的rfp强度进行校正。

　　g离心10分钟而形成。将球体生长2天，然后用200μl新鲜培养基替换培养基，该新鲜培养基含有10nm cytox green(thermofisher)和一系列浓度的kdc、kfdc、kadc或mmae。在4天后，加入胰蛋白酶

　　edta，将细胞置于60rpm振荡器上10分钟以破坏球体。使用biotek synergy h4微量滴定板读数器测量绿色荧光。通过将绿色荧光与用裂解缓冲液处理的球体进行比较来计算毒性百分比。

　　g离心10分钟而形成。将球体生长2天，然后用200μl新鲜培养基替换培养基，该新鲜培养基含有10nm cytox green(thermofisher)和0、50或100nm的kdc、kfdc、kadc或mmae。将球体在incucyte s3活细胞分析系统中温育5天，每4小时收集一次图像。

　　对于肿瘤细胞植入，将雌性nu/nu小鼠(charles river laboratory)用2.5％异氟醚通过以1l/min的流速吸入麻醉。将含有2.5

　　106个u87mg细胞的200μl体积的50/50pbs/matrigel(corning)皮下注射到右侧。允许肿瘤生长7天直到达到大约35mm2的大小。对于治疗功效研究，将小鼠分成实验组以确保所有组的平均肿瘤大小和起始体重相等。

　　如上所述，将携带u87mg侧腹异种移植物的小鼠静脉注射1.5nmol的alexa fluor 680标记的k、kfc或kab。使用ivis spectrum(perkinelmer)对小鼠进行成像。分别使用640nm和710nm的激发/发射波长检测荧光团缀合的蛋白质。所有成像分析均使用living image软件(caliper life sciences)进行。

　　如上所述，将携带u87mg侧腹异种移植物的小鼠静脉注射1.5nmol的alexa fluor 680标记的k、kfc或kab。在4小时和24小时的终点收集器官(肿瘤、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、心脏、肺、膀胱、股四头肌和骨骼)。使用ivis spectrum(perkinelmer)对器官进行成像。分别使用640nm和710nm的激发/发射波长检测荧光团缀合的蛋白质。所有成像分析均使用living image软件(caliper life sciences)进行。

　　如上所述，将携带u87mg侧腹异种移植物的小鼠静脉注射1.5nmol的alexa fluor 480标记的k、kfc或kab。4小时后取出肿瘤并在oct最佳切割温度化合物(oct；thermofisher scientific)中快速冷冻。安乐死前15分钟，还向小鼠静脉注射15mg/kg hoechst33342以可视化功能性脉管系统。将oct块切成15μm切片，并使用cy5.5标记的抗cd31对载玻片进行染色。然后使用倒置lsm 780多光子激光扫描共聚焦显微镜(zeiss)对染色载玻片进行成像。

　　如上所述，将携带u87mg侧腹异种移植物的小鼠静脉注射pbs、kdc、kfdc、kadc或对照蛋白质。每周进行一次治疗，持续四周。使用数显卡尺每周测量肿瘤三次，并在每个给药日记录动物体重以监测潜在的体重减轻，作为化合物毒性的量度。肿瘤面积计算为肿瘤的最长轴乘以垂直轴。安乐死标准定义为肿瘤面积大于150mm2或体重减轻20％。

　　因此，以上仅说明本公开的原理。应当理解的是，本领域技术人员能够设计各种布置，尽管未在本文明确描述或示出，但所述各种布置体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而贡献的概念，并且被解释为不限于这些具体列举的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，预期此类等同物包括当前已知的等同物以及未来开发的等同物，即，开发的不论结构如何执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并不

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